Упрощенная HTML-версия
культурой засевают в бульон и инкубируют при температуре 37
0
С в течение
18-24 часов. После лизиса культуры оставшиеся бактериальные клетки удаляют
центрифугированием или фильтрованием через бактериальные фильтры.
Наличие фага на бактериальном фильтре определяют качественным и
количественным методами.
Качественный метод определения фагов.
Чашку Петри с питательным агаром высевают суточной бульон культуры
бактерий газоном и подсушивают при 37
0
С в течение 10-15 мин. Затем на
поверхность газона наносят каплю фага и наклоняют так, чтобы капля стекла к
противоположному краю. После суточной инкубации в термостате
просматривают чашку, отмечая наличие зоны лизиса на месте стекания капли
фага.
Количественный метод определения титра фага по Грациа.
Для постановки опыта предварительно: а) разливают питательный агар в чашки
Петри, подсушивают в термостате; б) приготовленный полужидкий 0, 7 % агар,
разлитый по 3-4 мл в пробирки, растапливают в водяной бане. Делают
десятикратные разведения исследуемого фага (10
-2
, 10
-3
, 10
-4
….10
-7
, может быть
и дальше, в зависимости от предполагаемого титра) в изотоническом растворе
хлорида натрия. Затем 0,5 мл из последнего разведения фага смешивают с таким
же объемом бульонной культуры, чувствительных к фагу бактерий
,
и выливают
в пробирку с полужидким агаром, охлажденным до 45
0
С. Смесь быстро
выливают на поверхность агара в чашки Петри, где она застывает в виде тонкого
слоя. Так же готовят смесь из следующих разведения фага и т.д.
Не зараженные фагом бактерии, размножаясь образуют сплошной газон
роста на поверхности питательного агара. Каждая инфицированная фагом
бактерия лизируется и высвобождает потомство фага, состоящее из новых
фаговых частиц. Они внедряются в неповрежденные клетки и цикл повторяется
заново. В результате лизиса клеток на сплошном бактериальном газоне
появляются «стерильные» пятна или негативные колонии фага. Число этих
пятен соответствует количеству фаговых частиц в засеянной смеси. Исходя из